细胞焦亡是近年来发现并证实的一种新的程序性细胞死亡方式，其特征为依赖于炎性半胱天冬酶（主要是caspase-1，4，5，11），并伴有大量促炎症因子的释放。细胞焦亡的形态学特征、发生及调控机制等均不同于凋亡、坏死等其他细胞死亡方式。研究表明，细胞焦亡广泛参与感染性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病等的发生发展，并发挥重要作用，对细胞焦亡的深入研究有助于认识其在相关疾病发生发展和转归中的作用，为临床防治提供新思路。
细胞焦亡属于程序性细胞死亡方式，包括焦亡在内的还有凋亡、自噬、坏死等，都是曾经或者目前的国自然热点，小优在之前写过很多相关的文章，直达链接如下：（文末相关阅读推荐）
虽然焦亡作为程序性死亡的热门话题已经持续了一段时间，但是大家对他的研究从未停止，尤其是其机制研究。NLRP3炎症小体是引起细胞焦亡的一种经典途径，最近研究发现，通过WNK对细胞内离子浓度感知研究，可以调控NLRP3炎症小体，进而调控细胞焦亡。
通过WNK1信号传导调节NLRP3激活和细胞焦亡的模型
在NLRP3炎症小体启动步骤（信号1）之后，NLRP3激活刺激（信号2）诱导K+和Cl-从细胞流出，从而触发NLRP3炎症小体组装。WNK1感应到细胞内Cl-的减少并发生自磷酸化。WNK1磷酸化会介导其下游靶标STK39/OXSR1发生磷酸化，后者激活阳离子Cl-协同转运蛋白以恢复离子浓度并抑制进一步的Cl-流出。正常细胞内Cl-浓度的恢复进一步抑制NLRP3炎性--体激活和细胞焦亡。
NLRP3炎症小体是一种细胞内多蛋白复合物，在暴露于病原体和组织损伤后，它会组装并产生炎症免疫反应。这种复合物主要存在于巨噬细胞中，由NLRP3蛋白、ASC衔接蛋白和caspase-1的前体pro-caspase-1组成。NLRP3炎症小体是先天免疫中强大的参与者，可以抵御入侵的病原体和损伤，但NLRP3激活失调引起的过度炎症可归因于多种疾病，如炎症性肠病、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、痛风和阿尔茨海默病。因此，了解NLRP3的调节机制对于制定对抗这种过度炎症的治疗策略至关重要。
不含赖氨酸[K](WNK)丝氨酸/苏氨酸激酶是在所有哺乳动物中发现的激酶亚家族，其命名是因为它们在亚域II中缺乏催化赖氨酸，通常在激酶中保守以结合ATP。在渗透胁迫或细胞内低Cl-期间，WNK被激活并磷酸化效应激酶SPS/Ste20相关富含脯氨酸丙氨酸激酶(STK39)和氧化应激反应1(OXSR1)。STK39和OXSR1控制SLC12阳离子-Cl-协同转运蛋白家族的活性，从而调节细胞离子通量，即Na+、K+和Cl-。WNK信号传导途径对于维持血压和肾脏稳态至关重要，WNK1和WNK4的功能获得突变是导致多种高血压的原因。
最近的一项研究揭示了WNK1信号在通过胞吞作用去除凋亡细胞中的新作用。研究表明，WNK1或其下游靶标SLC12A2协同转运蛋白的破坏导致凋亡细胞吸收显着增加，并在吞噬细胞中从抗炎反应转变为促炎反应，表明WNK1信号传导在抑制炎症中的作用。
年-年pyroptosisPubmed发表文献数统计
今天解读的文章是来自Nature的一篇年的高分文献，题为“ChloridesensingbyWNK1regulatesNLRP3inflammasomeactivationandpyroptosis”，该文章发现了细胞焦亡的一种新的研究思路。表明WNK1通过其对阳离子Cl-浓度的调节，NLRP3炎性小体活化受到抑制，从而增加调控的另一层的NLRP3活化途径。话不多说，赶紧和小优一起解读文章吧，内容很多，全是干货，有需要的老师可以先收藏哦！
1.抑制WNK1增加NLRP3炎症小体激活
图1WNK对WNK的抑制增加了巨噬细胞中NLRP3炎性体的激活。
补充图1WNK-IN-11对WNK1的抑制增加了巨噬细胞中NLRP3炎症体的激活
为了研究无赖氨酸(WNK)激酶是否是细胞内离子稳态和细胞体积的主要调节剂,参与巨噬细胞中NLRP3激活的调节，作者评估了WNK激酶的药理学抑制对炎性体激活的影响。并用ATP，nigericin，或尿酸单钠（MSU）晶体处理LPS引发的原代骨髓源巨噬细胞（BMDM）在选择性使用WNK激酶的存在或不存在抑制剂WNK。文章中观察到NLRP3活化显着增加，这可以通过用ATP（图1a、b）、nigericin（图1a、b）或MSU（图1b、c)在WNK存在下与对照处理相比。作者观察到在WNK存在下用ATP、nigericin或MSU处理的细胞中碘化丙啶摄取增加（图1d-f）以及乳酸脱氢酶（LDH）释放增加（图1g）对照，表明焦亡增加。尽管WNK单独处理，在没有炎症小体激活的情况下诱导了TNF产生的显着增加（图1h），但炎症小体与ATP、nigericin或MSU的激活并没有进一步增加TNF的产生。WNK对TNF的这种作用似乎对该药物具有特异性，并且当BMDM用WNK1抑制剂11处理或当它们的WNK1被删除时未观察到。
由于WNK1在大多数组织中表达,并且已显示通过调节T细胞活性在免疫系统中发挥作用，作者测试了最近开发的特异性WNK1抑制剂11(WNK-IN-11)对NLRP3炎症小体的影响在LPS引发的初级BMDM中激活。与WNK类似，WNK-IN-11增加了NLRP3炎性小体的激活，如用ATP、nigericin或MSU处理的细胞培养上清液中的半胱天冬酶1激活和IL-1β产生所测量的（补充图1a、b）。与对照细胞相比，WNK-IN-11处理还增加了用ATP、nigericin或MSU处理的BMDM中碘化丙啶的摄取和LDH释放（补充图1d-g）。WNK-IN-11对TNF的产生没有影响（补充图1h）。结果表明WNK1在NLRP3炎症小体激活中起主要抑制作用，其抑制作用通过增加NLRP3寡聚化来增强炎症小体激活。
2.WNK1的条件性敲除增加了NLRP3炎症的某些激活
图2：他莫昔芬诱导WNK1敲除增加了巨噬细胞中NLRP3炎症小体的激活。
图3：条件性WNK1敲除增加了巨噬细胞中NLPR3炎症小体的激活
为了评估条件性WNK1缺失对NLRP3炎症小体激活的影响，作者用Pam3CSK4、PolyI:C或LPS引发了他莫昔芬处理的野生型和Wnk1-/flox-CreERT2+、iBMDMs，然后是ATP（图2a）。观察到与对照他莫昔芬处理的野生型细胞相比，他莫昔芬诱导的WNK1敲除细胞中NLRP3活化显着增加。这表明WNK1缺失不影响NLRP3启动步骤，但它增强了NLRP3激活步骤。这种增加与LDH释放增加有关（图2b、c），表明细胞焦亡增加。类似地，caspase1激活增加（图2d）、IL-1β释放（图2e）和PI摄取（图2f、g）)在用MSU刺激他莫昔芬处理和LPS引发的Wnk1-/flox-CreERT2+iBMDMs后，以剂量依赖性方式出现。在原代Wnk1-/flox-CreERT2+BMDM（未显示）中观察到类似的结果。总之，这些结果验证了WNK抑制剂数据，并强调了WNK1在调节NLRP3炎症小体激活中的重要性。
为了在不使用他莫昔芬的情况下开发一个模型并允许在体内评估WNK1缺乏对NLRP3炎症小体激活的影响，作者生成了携带在骨髓特异性Cre重组酶LysMCre控制下的floxedWnk1基因的小鼠。这些小鼠仅在完全分化的巨噬细胞中删除Wnk1，而不会干扰心血管发育。WNK1条件性敲除小鼠(Wnk1flox/floxLysMCre+)存活下来并且在表型上与它们的野生型同胞没有区别。从这些小鼠中分离的BMDM用LPS引发并用ATP、nigericin或MSU处理并分析caspase1激活和ASC寡聚化（图3a）、LDH释放（图3b））、IL-1β释放（图3a、c）和PI摄取（图3d-f）。与WNK1抑制剂和他莫昔芬诱导的Wnk1缺失的结果一致，作者观察到条件WNK1KOBMDM中NLRP3激活和细胞焦亡与其野生型对照相比显着增加（图3a-f）。总的来说，这些数据进一步验证了WNK1在抑制巨噬细胞中NLRP3炎症小体激活中的关键作用。
3.WNK1/OXSR1/STK39信号通路调节NLRP3的激活
图4：STK39/OXSR1的药理学抑制增加了巨噬细胞中NLRP3炎症小体的激活
WNK1通过激活氧化应激反应1(OXSR1)和STE20/SPS1相关的富含脯氨酸/丙氨酸(STK39)激酶来调节细胞内离子浓度，这些激酶通过作用于质膜Na+来调节细胞内Na+、K+和Cl-离子通量/K+、Cl-共转运蛋白。考虑到Cl-和K+流出在NLRP3激活中的重要作用，我们研究了WNK1对NLRP3激活的调节是否依赖于其典型的OXSR1/STK39信号通路。我们使用了两种不同的抑制剂，Rafoxanide和Closantel，它们通过结合到STK39和OXSR1激酶的C末端结构域上的变构位点来抑制它们。在用ATP（图4a）或咪喹莫特（图4b）刺激NLRP3之前，用Closantel或Rafoxanide预处理LPS引发的原代野生型BMDM10m导致与载体对照相比更多的碘化丙啶摄取。这些细胞还显示出更多的IL-1β产生（图4c）和LDH释放（图4d）)控制。当在永生化的野生型BMDM中测试这些抑制剂时，获得了类似的结果（图4e-g）。总之，这些结果表明规范WNK1/OXSR1/STK39激酶信号传导是控制NLRP3炎症小体激活所必需的。
4.WNK1通过Cl-传感机制调节NLRP3的激活
图5：WNK1通过Cl-感应机制调节NLRP3炎症小体激活
WNK1已被证明可以直接感知细胞内低Cl-浓度，导致其激活。一旦被激活，WNK1会磷酸化OXSR1和STK39激酶，进而磷酸化并激活SLC12A2(NKCC1)、SLC12A1(NKCC2)和SLC12A3(NCC)Na+,K+和Cl-共转运蛋白以维持细胞内正常的Na+,K+和Cl-离子浓度。WNK1通过在检测到细胞内Cl-下降时激活阳离子Cl-协同转运蛋白来抑制NLRP3激活的假设。激活的协同转运蛋白通过介导Cl-和K+从细胞外介质流入来抵消Cl-和K+损失。因此，WNK1将无法抵消氯-和K+时，野生型的BMDM刺激在Cl-损失-不含介质，因为阳离子Cl-共转运有氯的绝对要求-为他们的活动。LPS引发的野生型的BMDM表明显著更高IL-1β的生产，LDH释放和胱天蛋白酶-1激活（图5A-C）当与nigericin在含Cl刺激相对于对照介质free介质。此外，LPS引发的缺陷WNK1的BMDM，其预期具有没有协同转运蛋白活性，在nigericin的刺激free介质引起IL-1β的生产没有增加，LDH释放或胱天蛋白酶-1激活高于在可见正常对照培养基（图5）。事实上，炎性活化通过在WNK1KO细胞的IL-1β和LDH释放所量化的水平类似于在那些在氯的野生型细胞中看到--free媒体（图如图5a、b)所示，表明与正常培养基中的野生型BMDM相比，WNK1-KO中NLRP3炎性体的激活增加是由于WNK1缺失导致共转运蛋白活性受到抑制。这些结果表明，通过在无Cl-培养基中孵育来抑制协同转运蛋白活性可以对NLRP3活化产生与WNK1的缺失/抑制相同的作用。
图6：WNK1调节巨噬细胞中的细胞内Cl–
阳离子Cl-协同转运蛋白在WNK1介导的NLRP3激活调节中的重要性通过使用MQAE（一种荧光Cl-离子指示剂）测量细胞内Cl-得到进一步验证。在静息状态下，野生型和条件性WNK1敲除BMDM具有相似的细胞内Cl-水平。当用NLRP3刺激物nigericin、ATP或咪喹莫特而非AIM2炎症小体激活剂dA:dT处理时，与WNK1KOBMDM相比，野生型BMDM的细胞内Cl-损失显着降低（图6a-c，）。野生型BMDMs在nigericin或ATP处理后5分钟损失约25%的细胞内Cl-（图6a、b），在咪喹莫特处理后10分钟损失约30%的细胞内Cl-（图6c））。相比之下，条件性WNK1KO细胞以及用WNK处理的野生型BMDM在5到10分钟内失去了约50%的Cl-（图6a-c）。NLRP3刺激对细胞内Cl-水平的影响与NLRP3状态无关，因为在存在或不存在WNK1抑制剂的情况下用nigericin处理的NLRP3敲除BMDM显示出类似的Cl-模式在类似处理的野生型BMDM中观察到的损失。由于WNK1通过阳离子Cl-协同转运蛋白调节的K+通量与Cl-通量偶联，与用相同NLRP3刺激的WT对照相比，WNK1-KOBMDM中的细胞内K+损失也更大刺激（图6d-f）。这些结果表明，如果没有WNK1，BMDM无法在NLRP3激活期间抵消其细胞内Cl-和K+的损失，因为它们无法调节其阳离子Cl-协同转运蛋白，这解释了增加的NLRP3激活和细胞焦亡（图6g-l）。
5.K+和Cl-外排驱动WT和WNK1KO细胞中的NLRP3激活
图7：钾和Cl-流出驱动WT和WNK-KO细胞中的NLRP3激活
为了研究K+或Cl-流出是否促进WNK1缺陷型BMDM中NLRP3的激活，作者研究了了在无K+或无Cl-培养基中培养BMDM是否可以在没有外源性NLRP3刺激的情况下激活NLRP3炎性体。在无Cl-培养基中孵育导致WT和WNK1-KO细胞中细胞内Cl-的快速下降（图7a）。然而，在WT和WNK1-KO细胞中，在孵育的前50分钟内，细胞内K+的水平变化很小或没有变化（图7b）。然而，细胞内K+的水平在较晚的时间点仅在WNK1-KO细胞中适度下降（图7b）。在无K+培养基中孵育导致WT细胞中细胞内Cl-的小幅下降和K+的适度下降，但在WNK1-KO细胞中观察到细胞内Cl-和K+的更大下降（图7c,d)。对于在无Cl-培养基中的WT细胞，在细胞内K+没有类似下降的情况下，细胞内Cl-的下降（图7a，b）没有激活NLRP3炎性体，如通过IL-1β分泌所测量的（图7e））。相比之下，在无Cl-培养基中WNK1-KO细胞中细胞内Cl-的下降和细胞内K+水平的最终小幅下降（图7a、b）导致NLRP3活化（图7e）。无K+培养基中K+和Cl-水平的下降激活了WT和WNK1-KO细胞中的NLRP3炎性体，但WNK1-KO细胞中的NLRP3激活要大得多（图7c、d、f）。这些结果表明Cl-和K+流出都驱动NLRP3激活，并且这些通量受WNK1调节。
6.WNK1在体内调节先天免疫反应
图8：巨噬细胞中的WNK1敲除增加了体内NLRP3炎症小体的激活
为了证明体外发现的生理学相关性，作者研究了WNK1在NLRP3依赖性先天免疫反应中的作用。腹腔注射单钠尿酸盐(MSU)晶体会启动NLRP3依赖性免疫反应，其特征是中性粒细胞浸润和IL-1β释放到腹膜，研究员注射了8-12周大的Wnk1flox/floxLysMCre+小鼠和Wnk1+/+LysMCre+在收集和分析腹膜渗出液之前，用1mgMSU对NLRP3进行6小时“短”激活或16小时“长”激活。发现，在MSU处理6小时后，条件性WNK1KO小鼠的腹腔渗出液中的IL-1β水平显着高于野生型同窝小鼠（图8a）。渗出液的FACs分析揭示了条件WNK1KO小鼠中浸润性中性粒细胞数量的增加（图8b）以及中性粒细胞群体百分比的增加（图8c）。在MSU处理16小时后，结果观察到IL-1β释放（图8d）、浸润的中性粒细胞数量（图8e）和渗出液群体中的中性粒细胞百分比（图8d）增加。（图8f)在条件WNK1KO小鼠中与其野生型同窝小鼠相比。在短期或长期MSU治疗后，我们没有观察到TNFα水平的显着差异。总之，这些结果表明WNK1在体内NLRP3激活中起重要作用。
7.WNK4不会调节NLRP3激活
图9：WNK4敲除不会增加体外或体内NLRP3炎症小体的激活
WNK1和WNK4都是Cl-敏感性激酶，因此作者研究了WNK4是否像WNK1一样增强炎症小体激活，或者WNK4是否对WNK1起补偿作用，WNK1/WNK4双敲除会产生更多激活。与野生型相比，作者没有观察到WNK4KOBMDM中NLRP3激活的增加。由于Wnk4敲除在小鼠中不是致命的，当通过IL-1β释放（图9a）、LDH释放（图9b）或半胱天冬酶1激活（图9c)当受到多种炎性体刺激时。在测量MSU注射后的免疫反应时，作者也没有看到体内WNK1KO和WNK1/4DKO之间的可观察差异，如渗出液中的中性粒细胞百分比（图9d）、浸润到腹膜的中性粒细胞数量（图9e)，或IL-1β释放（图9f）。这些结果表明WNK1而不是WNK4在调节NLRP3激活和免疫反应中至关重要。此外，WNK4活性不能替代WNK1的丢失，因为与有条件的WNK1KO相比，WNK1/4DKO没有显示出显着影响。
总结：
上述文章强调了Cl-调节在NLRP3炎症小体激活中的重要性，通过检测巨噬细胞中的细胞内低Cl-水平，WNK1通过激活阳离子Cl-协同转运蛋白来平衡细胞内离子（Na+、K+和Cl-），从而抑制NLRP3炎症小体的激活，从而防止过度炎症。
本文重点在于首次证明尽管小分子咪喹莫特被认为通过K+独立机制，NLRP3炎症小体的激活对WNK1缺失或抑制敏感，表明离子（K+和Cl-）稳态在咪喹莫特诱导的NLRP3激活中起关键作用。
最后，研究表明了抑制WNK1通路的临床意义，包括使用利尿剂治疗高血压，因为可能会出现与WNK1通路调节NLRP3相关的炎症并发症。